New frontiers in malaria parasite and Anopheles mosquito engineering

Colloque organisé par Catherine Bourgouin et Robert Ménard du 30 septembre au 5 octobre 2004

Participants

Patricia Baldacci, John Barnwell, Mark Benedict, Catherine Bourgouin, Brendan Crabb, Hernando De Portillo, Marcelo Jacobs-Lorena, Jacob Koella, Robert Ménard, Geneviève Milon, Odile Puijalon, Alexander Rhaikel, David Roos, Isabelle Rosinski-Chupin, Artur Scherf, Kenneth Vernick, Andy Waters

 

Communications

  • John BARNWELL, Centre for Disease Control, Atlanta, USA, « Parasite transformation and schemes of malaria control »
  • Mark BENEDICT, Centre for Disease Control, Atlanta, USA, « Six Experimental Foundations of Genetic Control of Mosquitoes »
  • Catherine BOURGOUIN, Institut Pasteur, France, « RNAi for functional genomics : indications and limitations »
  • Isabelle CHUPIN, Institut Pasteur, France, « Exploring the transcriptome of An. gambiae salivary gland by SAGE »
  • Brendan CRABB, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australie, « P. falciparum transfection: progress toward an inducible system »
  • Marcelo JACOBS-LORENA , Malaria Research Institute, Baltimore, USA, « Genetic approaches for malaria transmission control »
  • Jacob KOELLA, Université Pierre et Marie Curie, France, « Malaria transmission: genetic structure of malaria parasites and vector compatibility »
  • Robert MENARD, Institut Pasteur, France, « Systematic mutagenesis in P. berghei »
  • Geneviève MILON, Institut Pasteur, France, « The skin and the liver: two tissues transiently subverted by Plasmodium »
  • Hernando del PORTILLO, Instituto de Ciências Biomédicas da USP, Sao Paulo, Brésil, « Gene expression studies: Shuttling between P. falciparum and P. vivax »
  • Odile PUIJALON, Institut Pasteur, France, « Animal/in vitro modelling/mimicking of human malaria(s) »
  • Alex RAIKHEL, University of California, Riverside, USA, « Synergistic anti-Plasmodium activities of Cecropin and Defensin in the transgenic mosquito Aedes aegypti »
  • David ROOS, University of Pennsylvania, USA, « Designing and Mining Pathogen/host/vector ‘Omics’ Databases »
  • Artur SCHERF, Institut Pasteur, France, « Epigenetics of var gene expression »
  • Ken VERNICK, University of Minnesota, USA, « Genomics of mosquito susceptibility and resistance to malaria infection »
  • Andy WATERS, Leiden University, The Netherlands, « Translation repression of gene expression »

 

Compte-rendu

Un groupe de 17 scientifiques s’est réuni dans le cadre somptueux de la Fondation des Treilles pour discuter des perspectives ouvertes par les développements récents dans le domaine de l’ingénierie génétique du parasite responsable du paludisme et de son moustique vecteur. Les participants, venant de diverses institutions européennes, américaines et australiennes, ont été choisis en raison de la diversité de leurs compétences, de façon à susciter les discussions les plus larges possibles, couvrant à la fois le parasite, son hôte mammifère et le moustique vecteur. Le thème central était celui de la révolution technologique intervenue ces dernières années, qu’il s’agisse du développement de techniques de génétique moléculaire ou de génomique fonctionnelle, tant chez le parasite que chez le moustique vecteur. Ces outils sont en effet incontournables pour progresser dans notre compréhension de la biologie du parasite, pour mieux appréhender les interactions hôte-parasite à un niveau moléculaire, et pour générer de nouvelles approches thérapeutiques et vaccinales.

David Roos (University of Pennsylvania, Etats-Unis) a ouvert le colloque en faisant le point sur les bases de données génomiques d’intérêt pour la recherche sur le paludisme. Les génomes du parasite Plasmodium falciparum, l’espèce plasmodiale responsable de plus de 90% de la mortalité due au paludisme, le génome du moustique Anopheles gambiae, le principal vecteur de la maladie en Afrique, et le génome de l’Homme, sont désormais connus. La banque de données PlasmoDB, créée par David Roos, compile des données de séquence (génomique et cDNA) et d’annotation du génome de diverses espèces de Plasmodium, les très nombreuses données de génomique fonctionnelle, en particulier de profils d’expression des gènes (ARN et protéines), mais aussi de polymorphismes, de comparaisons inter-espèces, de données cliniques, ou encore de littérature scientifique. David Roos a présenté cette banque de données, en insistant sur les moyens de son exploitation optimale et de son développement ultérieur, et en rappelant qu’elle n’est pas seulement utile dans l’étude de gènes individuels mais permet aussi aux chercheurs de poser leurs propres questions. Par exemple la recherche in silico de candidats vaccinaux (basée sur des critères tels que le stade de production, la localisation subcellulaire, le polymorphisme, etc…) aboutit à une liste qui contient de nombreux candidats déjà connus et validés par d’autres approches, et d’autres qui demandent à être testés. David Roos a aussi insisté sur l’intérêt du modèle Toxoplasma, parasite apicomplexe qui partage avec Plasmodium de nombreux traits structuraux et phénotypiques, pour sa grande maniabilité génétique et la richesse des outils de génétique moléculaire mis au point. Ce parasite permet notamment de très belles études par immuno-fluorescence de la biogenèse des organelles du parasite, révélant le caractère unique de la biologie cellulaire de ce parasite et des apicomplexes en général (apicoplaste, glideosome, vésicules sécrétoires -micronèmes et roptries- du pôle apical, etc…).
Un développement technologique majeur survenu au cours de ces 10 dernières années a été la mise au point de techniques de transformation génétique de plusieurs espèces plasmodiales, y compris P. falciparum. Les premiers succès ont été obtenus en 1995-1996, avec l’intégration d’ADN exogène dans le génome de P. falciparum et de P. berghei, une espèce qui infecte les rongeurs, par recombinaison homologue. Malgré le caractère toujours délicat de ces approches, de nombreux mutants ont été construits et la fonction des produits correspondants, en particulier des candidats vaccinaux, a été précisée. A l’heure actuelle, la limitation majeure de la manipulation du génome de Plasmodium réside dans le fait que le parasite est haploïde et que les gènes essentiels, en particulier ceux des stades érythrocytaires du parasite, ne peuvent être inactivés (l’événement de mutagenèse étant létal) ; la fonction des gènes importants ne peut donc être adressée génétiquement. Brendan Crabb (Walter Eliza Institute, Australie), après une présentation historique et technique de la transfection de P. falciparum, a décrit les progrès les plus récents obtenus avec ce système, et notamment des fréquences de transfection, et suggéré les approches possibles pour une mutagenèse conditionnelle du génome du parasite. Il a présenté les efforts de son laboratoire vers la mise au point d’une technologie basée sur le système tétracycline de régulation transcriptionnelle. Si le système « Tet-off » qui permet d’exprimer (ou de sur-exprimer) de façon contrôlée un gène d’intérêt, un dominant négatif ou une construction anti-sens, apparaît fonctionnel, par contre le système « Tet-on » qui permet une mutagenèse conditionnelle n’est pas encore utilisable chez P. falciparum. Un tel système serait pourtant d’une grande utilité pour pouvoir explorer génétiquement la fonction de protéines essentielles du parasite, en particulier celles de ses stades érythrocytaires.
Une autre limitation des techniques de transformation génétique est la lourdeur des expériences de mutagenèse, y compris celles visant à une mutagenèse constitutive. Ceci est dû, entre autres, à l’extrême richesse en bases A et T du génome de Plasmodium, rendant aléatoire l’obtention des constructions moléculaires de ciblage, ainsi qu’aux longs délais de sélection de parasites recombinants. Pour pouvoir transformer la masse impressionnante de données nouvelles de séquence et d’expression en une meilleure compréhension fonctionnelle du parasite et de ses produits, un axe majeur de recherche est de tenter de rendre ces techniques de mutagenèse plus simples et plus reproductibles. Le système rongeur (P. berghei) est un modèle d’étude utilisé de longue date, et la génétique moléculaire de ce système se révèle être d’un maniement plus aisé que celle de P. falciparum. Robert Ménard (Institut Pasteur, France) a présenté des résultats obtenus dans le système P. berghei, qui permettent d’envisager une mutagenèse systématique de gènes d’intérêt de ce parasite. Le système est basé sur l’utilisation d’un transposon dérivé de Tn5 et une approche en deux temps de mutagenèse navette. Un gène d’intérêt peut ainsi être inactivé par insertion d’un transposon chez Escherichia coli, par simple conjugaison bactérienne, et la copie sauvage du gène est ensuite remplacée par double recombinaison homologue par la copie mutagénisée. Cette méthode de mutagenèse possède l’avantage de ne plus nécessiter de manipulation/clonage d’ADN parasitaire. Une telle approche devrait pouvoir permettre la mutagenèse systématique de groupes de gènes d’intérêt, et grandement simplifier la caractérisation fonctionnelle des protéines correspondantes.

La régulation de l’expression des gènes de Plasmodium est encore très mal comprise. En particulier, une question cruciale est de savoir comment P. falciparum contrôle l’expression des gènes var, probablement la plus importante des familles multigéniques du parasite. Les produits de ces gènes var sont présents à la surface des globules rouges infectés, spécifient l’attachement de ces derniers aux cellules endothéliales (entraînant des complications, comme le neuropaludisme) et sont la cible d’anticorps protecteurs. Puisque les parasites n’expriment qu’un gène var à la fois (expression mutuellement exclusive) et peuvent alterner le gène exprimé, cette variation antigénique semble assurer l’évasion du parasite du système immunitaire de l’hôte et permettre l’établissement d’une infection chronique. Artur Scherf (Institut Pasteur, France) a présenté les résultats de son laboratoire sur l’étude des facteurs épigénétiques qui contrôlent l’expression de ces gènes var. A un niveau local, le remodelage dynamique de la chromatine apparaît marquer de façon différentielle les séquences 5’ UTR des gènes var actifs ou inactifs, permettant l’expression mutuellement exclusive de ces gènes. A un niveau régional, la régulation de l’expression des gènes var localisés au centre des chromosomes semble répondre à des mécanismes distincts de ceux qui assurent l’expression des gènes var situés dans les régions sub-télomériques. A un niveau global, le repositionnement nucléaire des loci var semble indiquer l’existence de régions nucléaires compatibles ou non avec la transcription des gènes. Il semble donc que le contrôle de l’expression des gènes var réponde à des facteurs complexes, dont une partie est assuré par des facteurs épigénétiques, certains étant identifiés (protéine Sir, histone acétylases, etc…). Le domaine du contrôle épigénétique de l’expression génique chez Plasmodium, et notamment de la variation antigénique, n’en est encore qu’à ses débuts mais réserve certainement de fascinants enseignements, et pourrait aussi identifier de nouvelles cibles de stratégies d’intervention contre le parasite.

Un autre mécanisme mystérieux de l’expression génique chez Plasmodium est le mécanisme de répression traductionnelle. Certains gènes sont transcrits par un stade parasitaire donné, mais les messagers correspondants ne sont traduits qu’au stade parasitaire suivant. Par exemple, le messager du gène Pbs28 est présent dans les gamétocytes femelles et le zygote, mais la protéine correspondante n’est produite que par l’ookinète. Les études comparatives entre le transcriptome et le protéome de P. falciparum ont suggéré la présence de nombreux gènes subissant une telle répression traductionnelle. Andy Waters (University of Leiden, Pays-Bas) a rapporté les résultats de travaux tentant d’expliciter certaines des bases moléculaires du phénomène. Celui-ci semble être sous le contrôle de séquences présentes dans les régions 5’ et 3’ UTR du gène/messager qui pourraient se lier et cycliser le messager. Après avoir suggéré les approches permettant d’identifier le(s) répresseur(s) traductionnel(s), Andy Waters a proposé que les mécanismes de répression traductionnelle chez Plasmodium puissent être détournés et exploités comme moyen de lutte contre le parasite. En effet, beaucoup de messagers codant pour des protéines nécessaires au développement du parasite chez le moustique sont pré-produits, mais non traduits, par le stade gamétocyte du parasite chez l’hôte mammifère. Si la répression traductionnelle de ces messagers pré-synthétisés pouvait être débloquée, alors les protéines correspondantes pourraient être produites prématurément chez l’hôte mammifère (chez lequel de grandes quantités de gamétocytes sont dégradés) et induire la production d’anticorps correspondants. La transmission des parasites se ferait alors conjointement avec ces anticorps, qui pourraient ainsi bloquer le développement du parasite chez le moustique, à la façon des vaccins (altruistes) bloquant la transmission du parasite.

A l’heure actuelle, des outils de génétique moléculaire ne sont disponibles chez Plasmodium que pour les espèces P. falciparum et P. berghei. L’espèce P. vivax, quireste un problème majeur de santé publique, notamment en Asie et en Amérique latine, ne peut être étudiée par des outils génétiques. Hernando del Portillo (University of Sao Paulo, Brésil) a rappelé la biologie de ce parasite ainsi que les difficultés de son étude, et a fait le point sur les tentatives de transfection du parasite, jusqu’ici non couronnées de succès. Des études de transfection hétérologue (transfection d’ADN de P. vivax chez P. falciparum) devraient néanmoins permettre de caractériser les régions promotrices de P. vivax.

Le genre Plasmodium comporte de très nombreuses espèces, dont seulement 4 infectent l’homme (P. falciparum, P. vivax, P. malariae et P. ovale). D’autres espèces, notamment celles infectant les rongeurs comme P. berghei et P. yoelii, ou celles infectant les primates comme P. knowlesi, sont traditionnellement utilisées comme modèles d’étude des plasmodies humaines. Odile Puijalon (Institut Pasteur, France) a rappelé certaines des différences qui existent dans la biologie des plasmodies humaines et non humaines, et posé la question de savoir en quoi les plasmodies non humaines représentent effectivement des modèles adéquats pour l’étude du paludisme humain. Par exemple, le temps de développement/maturation dans le foie de l’hôte mammifère est beaucoup plus long pour P. falciparum (1 semaine environ) que pour P. berghei ou P. yoelii (2 jours), suggérant que ces deux types de parasites puissent initier des réponses immunitaires très différentes chez leur hôte respectif. En revanche, le développement de ces parasites chez leur hôte naturel, au moins au plan cellulaire, est semblable, et plus de 80% des gènes de P. falciparum possèdent des orthologues chez P. berghei/P. yoelii, suggérant que l’étude de la fonction des produits de P. falciparum puisse bénéficier des modèles rongeurs, dont le maniement est plus simple. Il semble donc que la validité de l’utilisation de modèles, en particulier rongeurs, dépende de la question posée. Enfin, Odile Puijalon a insisté sur la nécessité de développer de nouveaux modèles de vaccination, en particulier pour les enfants et les femmes enceintes, ainsi que des modèles d’étude des formes graves de la maladie, qui font toujours défaut.

La gamétocytogenèse est une des étapes les plus étudiées de la vie du parasite. Pourtant, le signal (ou les signaux) induisant la gamétocytogenèse du parasite, c’est-à-dire sa transformation de la forme asexuée en forme sexuée à l’intérieur du globule rouge, reste(nt) inconnu(s). Geneviève Milon (Institut Pasteur, France) a rappelé les caractéristiques structurales et fonctionnelles majeures des globules rouges : leur formation dans la moelle osseuse, leur ‘contrôle de qualité’ dans la pulpe rouge de la rate, leur cytosquelette sous-cortical (un complexe multimoléculaire dynamique modifié par le parasite intracellulaire), leur membrane plasmique (dans laquelle des protéines parasitaires peuvent s’insérer), et leurs fonctions hémoglobine-dépendantes. Une idée provocante suggérée par Geneviève Milon a été que le parasite possède une machinerie lui permettant de sentir la tension en oxygène, et que celle-ci puisse déterminer des changements de stade chez le parasite. A l’appui d’une telle hypothèse, les gamétocytes sont d’abord détectés dans la moelle osseuse, où la pression partielle en O2 est basse. De même le sporozoïte traverse durant son périple jusqu’au foie des milieux où la pression en O2 est très variable, depuis les glandes salivaires, où la pression est celle de l’air ambiant, jusque dans la peau, où cette pression chute (18 à 5%) et enfin dans le foie, où règne une relative hypoxie (normoxie hépatique). Le parasite pourrait-il s’adapter et se transformer en fonction de la pression en O2 ?

John Barnwell (Centre for Disease Control, Etats-Unis) a présenté les possibilités actuelles de prévention et de traitement de la maladie, ainsi que quelques perspectives sur les approches à venir. Tout d’abord, un peu d’histoire (récente) nous a rappelé que les efforts pour contenir la maladie ont connu un certain succès dans le passé, grâce surtout aux insecticides (en particulier le DTT) et aux traitements anti-parasitaires (en particulier la choloroquine). Pourtant, on assiste à l’heure actuelle à une recrudescence du nombre de cas de paludisme, qu’on impute volontiers au nombre croissant de moustiques résistants au DTT ainsi que de parasites résistants à la chloroquine. Bien que de nouvelles drogues efficaces existent, comme l’artémisinine, les études les plus récentes indiquent que des résistances à cette drogue sont déjà apparues. Du côté de la vaccination, les perspectives ne sont guère réjouissantes, John Barnwell ne prédisant pas de vaccin commercialisable avant au moins une vingtaine d’années. Des études récentes dans les modèles rongeurs ont redonné un certain intérêt aux approches vaccinales basées sur des parasites vivants atténués. Le premier vaccin contre le paludisme à avoir démontré une certaine efficacité, proposé pour la première fois à la fin des années soixante, était constitué de sporozoïtes (le stade parasitaire injecté par le moustique) vivants mais irradiés. L’injection de tels sporozoïtes (dont le développement dans le foie de l’hôte est bloqué) entraîne une protection durable et solide contre des sporozoïtes infectieux, dans les modèles rongeurs et primates ainsi que chez l’homme. Leur efficacité n’a pas encore été égalée par les approches plus modernes de vaccination, notamment les vaccins sous-unitaires. Cependant, une vaccination par des parasites vivants a toujours été considérée comme impraticable sur le terrain, pour des raisons à la fois logistiques et éthiques, et potentiellement risquée. Il a été montré récemment dans un modèle rongeur que des sporozoïtes génétiquement modifiés pour que leur développement soit bloqué dans le foie pouvaient aussi entraîner une protection durable. Bien que l’utilisation de parasites génétiquement modifiés ne résolve pas tous les problèmes posés par l’utilisation de parasites irradiés, elle semble avoir revitalisé l’approche vaccinale à l’aide de parasites vivants. Des formes érythrocytaires vivantes du parasite sont aussi à l’étude comme protection contre les stades érythrocytaires du parasite. Comme l’a montré la discussion, la question de savoir si l’avenir de la vaccination anti-palustre réside dans le développement de vaccins vivants, ou de vaccins sous-unitaires plus efficaces, reste très débattue.

Grâce à la diversité des compétences des entomologistes participant à ce colloque, diverses facettes du rôle du moustique Anopheles dans la transmission du paludisme, et des possibilités de son contrôle, ont pu être discutées. Une des idées motrices dans ce domaine, mais aussi une des plus controversées, est celle qui propose de contrôler la transmission de Plasmodium par l’intermédiaire de moustiques génétiquement modifiés, relâchés sur le terrain. Mark Benedict (Centre for Disease Control, Etats-Unis) a présenté les bases expérimentales pour un tel contrôle génétique de la transmission de Plasmodium par les moustiques Anopheles. Selon lui, six démonstrations expérimentales doivent être obtenues avant de pouvoir envisager un tel contrôle. La technologie de construction et de libération de moustiques transgéniques sur le terrain posant de nombreux problèmes, notamment d’acceptation par le public, il est essentiel de pouvoir d’abord démontrer la faisabilité de certains aspects d’une telle approche à l’aide de moustiques non transgéniques. Ces six fondements sont : (i) produire une souche ‘libérable’ de moustiques génétiquement modifiés ne permettant plus la transmission d’un virus ou d’un parasite (Plasmodium ou autre) , et démontrer la non transmission de l’agent sauvage par ces moustiques au laboratoire. (ii) Augmenter la fréquence d’un trait génétique dans la population sauvage ; jusqu’à maintenant, aucun déterminant génétique n’a jamais été délibérément augmenté dans une population vectrice sauvage. (iii) Eliminer les femelles (elles piquent et transmettent les pathogènes !) des moustiques libérés, car il n’est pas éthiquement ou épidémiologiquement acceptable de libérer des femelles si des méthodes ne sont pas disponibles pour pouvoir les éliminer. (iv) Démontrer la stabilité d’un trait effecteur (s’opposant à la transmission) dans la population sauvage ; il est en effet important de montrer que la mutation effectrice n’entraîne pas d’effet délétère sur le moustique porteur du trait. (v) Démontrer qu’il est possible de réduire la transmission de la maladie grâce à l’utilisation de moustiques transgéniques. (vi) Produire et distribuer de grandes quantités de moustiques.

A l’heure actuelle, une des plus grosses difficultés pour implémenter une approche de contrôle de la transmission du parasite via l’utilisation de moustiques transgéniques est le développement d’une méthode permettant d’introduire un ou des gènes de résistance dans la population sauvage de moustiques. Dans ce but, des stratégies telles que l’utilisation d’éléments transposables ou de Wolbachia ont été proposées. Une autre approche du contrôle de la transmission de Plasmodium par Anopheles a été présentée par Marcelo Jacobs-Lorena (Baltimore, Etats-Unis). Cette stratégie alternative repose sur l’utilisation de bactéries résidant dans la lumière intestinale du moustique (symbiotiques), où se déroulent les phases initiales du développement du parasite, et modifiées pour qu’elles expriment des molécules anti-parasitaires comme le peptide SM1, qui semble pouvoir bloquer le passage de la barrière intestinale du moustique par les ookinètes de P. berghei. Sur cette base, Marcello Jacobs-Lorena a discuté les possibilités d’exploiter cette approche en identifiant les espèces bactériennes présentes naturellement chez les moustiques (soit transmises de la larve à l’adulte, soit ingérées avec les nectars, sources d’alimentation sucrées des moustiques). De telles bactéries transformées in vitro pour l’expression de molécules antiparasitaires pourraient ensuite être diffusées sur les moustiquaires, comme un insecticide.

Les travaux présentés par Alex Raikhel (University of California, Etats-Unis) sur le modèle Aedes aegypti, vecteur expérimental de P. gallinaceum, une espèce plasmodiale qui infecte les oiseaux, ont suivi une démarche similaire. Des résultats ont d’abord démontré l’effet anti-plasmodial des défensines et des cécropines, deux familles majeures de peptides anti-microbiens présents chez les moustiques. L’équipe d’Alex Raikhel a donc construit, grâce à la technologie de transgenèse qui est efficace chez l’espèce Aedes aegypti, des moustiques exprimant (individuellement ou en association) une cécropine (CecA) et une défensine (DefA), sous le contrôle d’un promoteur (Vg) actif après la prise d’un repas sanguin. Les moustiques exprimant les deux peptides séparément sont effectivement plus résistants à l’infection par P. gallinaceum, avec une très nette diminution du nombre d’oocystes dans l’intestin et des sporozoïtes dans les glandes salivaires, alors que les moustiques exprimant les deux peptides sont totalement réfractaires à la transmission du parasite. L’expression ciblée de manière spatio-temporelle de molécules antibactériennes pourrait donc bloquer le développement de Plasmodium chez le moustique, et cette approche est actuellement à l’étude dans le modèle An. stephensi–P. berghei (modèle rongeur).

Un autre but de la communauté entomologique est d’identifier et de caractériser la fonction de gènes du moustique, qu’ils soient exprimés dans l’intestin ou les glandes salivaires, dont l’expression est modifiée par la présence de Plasmodium et qui pourraient ainsi jouer un rôle direct sur son cycle de vie. Isabelle Chupin (Institut Pasteur, France) a rapporté les résultats d’une analyse par SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) des gènes d’Anopheles gambiae dont l’expression est augmentée ou diminuée dans les glandes infectées par des sporozoïtes de P. berghei. Cette analyse a permis d’identifier de très nombreux nouveaux gènes du moustique qui pourraient jouer un rôle (positif ou négatif) dans la maturation des sporozoïtes dans les glandes salivaires du moustique, en particulier certains codant pour des produits de la salive et pouvant interférer avec le pouvoir infectieux du parasite. Cette analyse a aussi permis d’identifier de nouveaux gènes exprimés par le stade sporozoïte du parasite, et qui pourraient jouer un rôle dans l’infection de l’hôte mammifère.

Le groupe de Ken Vernick (University of Minnesota, Etats-Unis) a développé une approche post-génomique globale, basée sur l’utilisation de microarrays et de protéomique, pour identifier les modifications de l’expression de gènes du moustique survenant après la prise de sang infecté. Les analyses, réalisées sur le couple An. Gambiae–P. falciparum provenant du terrain (Mali) ou du laboratoire, ont permis d’identifier plus de 200 nouveaux gènes dont l’expression est modifiée par le repas sanguin infecté. Il apparaît surtout que l’infection par Plasmodium éteigne de très nombreux gènes du système immunitaire du moustique, par un mécanisme qui semble avant tout une réduction transcriptionnelle, alors que d’autres gènes, moins nombreux, voient leur expression augmenter par l’infection parasitaire. La nature du signal répresseur reste inconnu, mais semble survenir environ 6 h avant l’invasion de la muqueuse intestinale du moustique par les ookinètes. Une discussion s’en est suivie sur le bien fondé de cibler le système immunitaire du moustique pour tenter d’augmenter sa résistance à l’infection par Plasmodium, par exemple par une approche de moustiques génétiquement modifiés. En effet, l’inactivation d’un gène activé par l’infection, ou au contraire la surexpression d’un gène réprimé par l’infection, pourrait en théorie réduire le développement du parasite et donc sa transmission. Pourtant, l’idée qui semble faire consensus est que la modification de l’expression d’un gène du système immunitaire du moustique (de résistance ou de sensibilité au parasite) a toutes les chances d’être contournée par le parasite, qui coévolue avec le moustique et son système immunitaire depuis si longtemps.

Toute entreprise de génomique fonctionnelle devrait pouvoir bénéficier d’outils permettant d’inactiver un gène d’intérêt ou de diminuer son expression, de façon à pouvoir comprendre la fonction de son produit. De tels outils ne sont pas encore complètement au point chez Anopheles. Certains succès ont été obtenus dans la transgenèse d’An. gambiae (ainsi que d’An. stephensi), mais sa mise en œuvre reste difficile et ne semble pas encore compatible avec des analyses en routine. Catherine Bourgouin (Institut Pasteur, France) a discuté les développements récents de la technique d’ARN interférence chez Anopheles. Alors que cette technique, basée sur l’injection de molécules d’ARN double brin dans l’hémolymphe du moustique, permet d’interférer avec l’expression de gènes exprimés dans l’intestin du moustique, la même technique semble moins efficace pour diminuer l’expression de gènes de glandes salivaires du moustique. Les raisons de cette différence d’efficacité restent obscures et pourraient refléter une imperméabilité de la membrane basale des glandes salivaires aux molécules d’ARN, ou leur dégradation spécifique à l’intérieur des glandes. La technique d’ARN interférence semble donc plus efficace pour l’analyse fonctionnelle du passage du parasite à travers la muqueuse intestinale que pour celle de la maturation du sporozoïte dans les glandes salivaires et l’acquisition de son pouvoir infectieux pour l’hôte mammifère.

Enfin, Jacob Koella (Université Pierre et Marie Curie, France) a présenté des données sur la structure génétique de populations de Plasmodium et de moustiquescollectés dans une zone géographique donnée au Kenya. Ces données montrent que la résistance d’un moustique Anophèle au développement de P. falciparum, un aspect majeur de sa compétence vectorielle, varie considérablement entre diverses combinaisons d’isolats parasitaires de vecteurs individuels, génétiquement variables. En d’autres termes, une sous-population de moustiques peut résister à une partie des parasites, alors que d’autres moustiques peuvent résister à d’autres parasites, mais aucun génotype de moustique ne se révèle résistant à tous les parasites utilisés. La transmission optimale pourrait donc nécessiter une compatibilité spécifique entre les génotypes du parasite et celui du vecteur. Ce résultat a des conséquences importantes pour comprendre l’épidémiologie du paludisme. Il suggère que les conclusions tirées à partir de sous populations particulières de moustiques ou de parasites, en particulier en laboratoire, puissent ne pas être valables pour d’autres combinaisons de génotypes. Des études de terrain, prenant en compte la diversité des populations de moustiques et de parasites, seront donc nécessaires si l’on veut atteindre des conclusions valides qui puissent orienter efficacement les technologies de modification de moustiques développées au laboratoire. Ces résultats suggèrent aussi qu’il sera difficile de découvrir un gène unique qui puisse être utilisé comme moyen efficace et universel de contrôle de la transmission de Plasmodium.

La réunion s’est terminée par une discussion générale au cours de laquelle un tableau récapitulant des éléments identifiés comme importants pour une meilleure compréhension et un meilleur contrôle du paludisme a été élaboré. Pour chaque stade du parasite, les questions les plus pressantes, le modèle le plus adéquat, les outils les plus appropriés, et les problèmes prévisibles ont été débattus.